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    公开号:WO1985000816A1
    申请号:PCT/EP1984/000244
    申请日:1984-08-10
    公开日:1985-02-28
    发明作者:Hubert KÖSTER；Nanda Dual Sinha
    申请人:Koester Hubert；
    IPC主号:C07H21-00
    专利说明:
    [0001] Beschreibung Verfahren zur Herstellung von Oligonudeotiden
    [0002] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligonudeotiden der im Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel I. Die erfindungsgemäß hergestellten Oligonucleotide weisen definierte Sequenzen auf und können als spezifische Primer und Probes eingesetzt werden bzw. sind für die Synthese kompletter Gene von großer Bedeutung (Arzneimittelforschung 30, 3a, 548, (1980)).
    [0003] Oligonucleotide werden nach dem neusten Stand der Technik entweder nach der Phosphat- oder Phosphittriestermethode unter Verwendung polymerer Träger hergestellt (Nachr. Chem. Tech. Lab. 2 9, 230 (1981)). Um definierte Sequenzen aufbauen zu können, müssen die einzelnen Bausteine (Nucleoside bzw. Nucleotide) mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden. Hier werden für den Schutz der exocyclischen Aminogruppen der heterocyclischen Nucleobasen allgemein basenlabile Acylgruppen, für die Verankerung der Oligonucleotidkette mit dem polymeren Träger in üblicher Weise eine basenlabile Esterbindung und für den Schutz der primären 5'-OH-Gruppe die säurelabilen Tritylethergruppen verwendet. Als Phosphatschutzgruppe der PhosphattriesterMethode wird üblicherweise entweder die 2-Chlorphenyloder 4-Chlorphenylgruppe in esterartiger Bindung verwendet, die nur durch den Angriff einer Base oder eines Nucleophils am Phosphoratom entfernt werden kann. Ein solcher Schritt ist an sich unerwünscht, da damit die Gefahr einer Spaltung der internucleotidischen Phosphatesterbindung gegeben ist. Diese Gefahr wurde durch die Verwendung von Oximat-Anionen (Tetrahedron Lett. 19, 2727 (1978)) stark reduziert, obwohl diese auch im entscheidenden Schritt in unerwünschter Weise am Phosphoratom angreifen und darüberhinaus den Nachteil aufweisen, daß eine verhältnismäßig geringe Menge an erwünschtem Oligonucleotid mit sehr großen Mengen an nicht flüchtigen und schwer extrahierbaren Salzen verunreinigt ist. Dies erschwert nicht nur die Aufarbeitung und nachfolgende Reinigung des synthetisierten Oligonucleotids, sondern führt auch zu erheblichen Substanzverlusten.
    [0004] In der Phosphittriester-Methode wird üblicherweise die Methylgruppe in esterartiger Bindung als Phosphatschutzgruppe verwendet, die durch Angriff eines Nucleophils am Methyl-C-Atom entfernt werden kann (J. Amer. Chem. Soc. 99 , 3526 (1977)). Da ein Angriff am P-Atom vermieden wird, wird die Gefahr einer Spaltung der Internucleotidbindung ebenfalls vermieden. Als Nucleophil wird üblicherweise Thiophenol/Triethylamin verwendet, die unangenehm zu handhaben sind und außerdem zu nicht flüchtigen, schwer extrahierbaren Verbindungen führen, die - wie oben erwähnt - sowohl die Aufarbeitung erschweren als auch zu erheblichen Materialverlusten führen.
    [0005] Obwohl die eigentliche Synthese von Oligonudeotiden nach der Festphasen -Phosphit - bzw. Phophattriester-Methode recht effizient und schnell verläuft, ist die Herstellung von Oligonudeotiden definierter Sequenz nach wie. vor sehr zeitaufwendig. Dies liegt vor allem an den Problemen der nachfolgenden Aufarbeitung und Reinigung, die ein Mehrfaches der eigentlichen Synthesezeit beanspruchen. An diesem Punkt setzt das Verfahren der Erfindung ein, das hier eine entscheidende technische Verbesserung bietet,
    [0006] Um zu Verbindungen der im Anspruch 1 angegebenen Formel I zu gelangen, in denen B eine Nucleobase, z.B. Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U) oder deren Analoga und R1 Wasserstoff, Hydroxyl bzw. mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sowie n eine ganze Zahl von 1 bis 200 bedeuten, sind erfindungsgemäß verschiedene, definierte Reaktionsschritte durchzuführen:
    [0007] a) Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II.
    [0008] R der allgemeinen .Formel II kann Wasserstoff sein; es handelt sich dann bei den Verbindungen der Formel I um Oligodesoxynucleotide. Die Gruppe R1 kann auch Hydoxyloder gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl sein. Derartige Schutzgruppen sind z.B. Trityl, Moncmethoxytrityl und Dimethoxytrityl, Acyl, z.B. Acetyl, Benzoyl; Tetrahydropyranyl, Methoxytetrahydropyranyl , o-Nitrobenzyl sowie Silylether wie z.B. t-Butyl-Diphenylsilylether. Eine allgemeine Übersicht über in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppen findet sich z.B. in Tetrahedron 1981, Seite 363 - 369, Liebigs Ann. Chem. 1978, 839 - 850, sowie Nucleic Acids Research, Symposium Series No. 7, 1980, 39 - 59.
    [0009] R2 ist ebenfalls eine in der Nucleotidchemie übliche
    [0010] Schutzgruppe gemäß den vorgenannten Veröffentlichungen, vorzugsweise die säurelabile 4,4-Dirrethoxy- oder 4,4,4Trimethoxytritylgruppe. B' kann ebenfalls eine in 'der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe gemäß den oben genannten Vorveröffentlichungen aufweisen. Das Nucleosid der Formel II wird erfindungsgemäß mit einem Phosphinderivat der allgemeinen Formel III gemäß Anspruch 1 umgesetzt.
    [0011] In der allgemeinen Formel bedeutet X Chlor, Brom, CN oder
    [0012] SCN; L bedeutet Chlor, Brom, CN, SCN oder einen Aminrest der Formel
    (Formel VIII), wobei die Gruppen R4 primäre, sekundäre oder tertiäre Alkyreste mit 1 - 10 Kohlenstoffatomen sind oder zusammen einen Cycloalkylrest mit 5 - 7 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls mit Alkylverzweigungen,und/oder einem oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefelatomen als Heteroatome enthalten kann, bedeuten. Die Gruppe L kann auch einen reaktiven heterocyclischen Rest bilden, der Imidazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, 3-Nitro-1,2,4-triazolyl, Thiazolyl, Pyrrolyl, Benztriazolyl (gegebenenfalls mit Substituenten im Phenylrest) oder Benzhydroxytriazolyl (gegebenenfalls mit Substituenten im Phenylring) und dergleichen bilden.
    [0013] R3 des Phosphinderivats der allgemeinen Formel (III) ist erfindingsgemäß eine mit Hilfe von Basen durch ß-Eliminierung entfernbare Gruppe der allgemeinen Formel VII, in der Y Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet. Z stellt eine elektronenziehende Gruppe dar, z.B. Halogen wie Fluor, Chlor oder Brom, CN, NO2. Z kann weiterhin Phenyl, Phenylthio, Phenylsulfoxy oder Phenylsulfonyl bedeuten, wobei die Phenylreste in o, o'-Stellung und/oder p-Stellung mit Halogen, CN oder NO2 substituiert sein können. Anstelle der Gruppe
    [0014] kann auch eine der Gruppen CF3, CCl3 oder CBr3 stehen.
    [0015] Die Umsetzung gemäß Schritt a erfolgt in Gegenwart einer organischen Base.
    [0016] b) Umsetzung des in Schritt a erhaltenen Nucleosidphosphorigsäure-Derivates der Formel IV.
    [0017] Die Umsetzung der Verbindung gemäß Formel IV erfolgt mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V gemäß Anspruch 1. Es können lösliche oder unlösliche, d.h. vernetzte, polymere Träger verwendet werden, z.B. modifiziertes Silicagel, Glas, insbesondere "controlled poreglass", Polyester, Polyamid, Polyvinylalkohol, Polysiloxan, Polystyrol oder dergleichen. Als Verankerungsfunktion. zwischen Träger und Nucleosid kommen vorzugsweise Esterbindungen in Betracht, einschließlich solcher, die sich von Lävulinyl- oder ß-Benzoylpropionylrest ableiten; die letztgenannten Esterbindungen können unter neutralen Bedingungen mit Hydrazin gespalten werden. Auch die säurelabile Trityletherbindung, gegebenenfalls mit Substiuenten in den Phenylringen, kommt als Verankerungsmöglichkeit in Betracht, vgl. Liebigs Ann. Chem. 1974, 959.
    [0018] c) Oxidation des in Stufe b erhaltenen trägergebundenen Nucleotidonucleosids der allgemeinen Formel VI.
    [0019] Die Oxidation führt zu einer Phosphatgruppe; sie kann z.B. mit Jod/H2O, H2O2 oder organischen Persäuren oder allgemein durch Oxidation durch Einführung von O, S oder Se durchgeführt werden.
    [0020] d) Maskierung freier primärer 5'-OH-Gruppen, die bei der Reaktion gemäß Stufe b (imProdukt der Formel V) nicht umgesetzt wurden.
    [0021] Diese freien Hydroxylgruppen werden mit einer permanenten Schutzgruppe maskiert, z.B. durch Reaktion mit Acetanhydrid.
    [0022] e) Abspaltung der Schutzgruppe (n) R2
    [0023] Die Abspaltung erfolgt beispielsweise unter Verwendung einer Protonsäure oder Lewissäure wie ZnBr2 oder Dialkylaluminiumchlorid, wenn R2 eine Tritylgruppe oder Methoxyderivat derselben darstellt.
    [0024] f) Einführung weiterer Nucleosidphosphat- oder Oligonucleosidphosphateinheiten
    [0025] Die Stufen a - e können wiederholt werden, wobei mindestens ein Nucleosidphosphatrest eingeführt wird. Beim Einsatz von Oligonucleosidphosphateinheiten werden selbstverständlich Kettenverlängerungen um mehr als eine Nucleosidphosphateinheit erreicht.
    [0026] g) Abspaltung sämtlicher Schutzgruppen
    [0027] Diese Abspaltung kann in der Weise erfolgen, daß mit wässrigem Ammoniak in einem Schritt die N-Acylgruppen der heterocyclischen Basen, die Esterbindung zwischen Oligonucleotid und Träger (gegebenenfalls kann letztere unter neutralen Bedingungen auch mit Hydrazin gespalten werden) und die Phosphatschutzgruppe gemäß dem allgemeinen Schema 1 am Schluß der Beschreibung durch ß-Eliminierung abgespalten werden. Es wird dann ein Oligonucleotid mit nur 5 ' -terminaler Tritylschutzgruppe erhalten, das in an sich bekannter Weise nach Entfernung der flüchtigen Base (Ammoniak) direkt durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) an "reversed phase"-Material gereinigt werden kann.
    [0028] Die Zwischenprodukte der allgemeinen Formel IV gemäß Anspruch 1 stellen neue Verbindungen dar. Sie liegen in Form recht stabiler, in reiner Form darstellbarer Verbindungen vor, sind leicht zu handhaben und dennoch recht reaktiv im Sinne der Knüpfung von Internucleotidbindungen. Der Einsatz von R3 als eine durch Basen über ß-Eliminierung entfernbare Schutzgruppe ermöglicht es zum ersten Mal, bis auf die 5'-Tritylgruppe alle Schutzgruppen in einem Schritt abzuspalten, wobei vorteilhafterweise durch Verwendung flüchtiger Basen das gewünschte Oligonucleotid in nur sehr geringem Maße mit Fremdstoffen verunreinigt ist und damit direkt nachfolgend durch die noch vorhandene hydrophobe 5'-Tritylgruppe über "reversed phase"-HPLC gereinigt werden kann.
    [0029] Ein weiterer Vorteil des Verfahrens der Erfindung ergibt sich daraus, daß durch die Entfernung der Schutzgruppe durch ß-Eliminierung kein Angriff am P-Atom erfolgt und damit an keinerder neu geknüpften Internucleotidbindungen während des Entschützens gespalten werden kann. Das Verfahren der Erfindung führt damit bei stark reduziertem Zeitaufwand zu insgesamt reineren Produkten als die bisher verfügbaren Verfahren.
    [0030] Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert, wobei Phophinderivate zur Anwendung kommen, in denen R3 ein ß-Cyanethylgruppe ist. Einzelheiten der Reaktion und physiklische Kenndaten der hergestellten Verbindungen ergeben sich aus den Schemata 2 und 3, der Tabelle 1, sowie den Figuren 1 - 7 am Schluß der Beschreibung.
    [0031] Beispiel 1:
    [0032] Herstellung von Phosphinderivaten der allgemeinen Formel III:
    [0033] Monochlor-ß-cyanethyl-phosphoramidite:
    [0034] Eine allgemeine Übersicht über die Reaktion ist aus Schema 1 ersiσhtlicht.
    [0035] Dichlor-ß-cyanethoxyphosphin ( 1 ) wird mit einigen Verbesserunge im übrigen jedoch wie in Can. J. Chem. 58, 2686 (1980)) dargestellt:
    [0036] 137,5 g (1,0 Mol) PCl3 werden in einem Dreihalskolben mit Tropftrichter mit 300 ml Ether und 79,0 g (1 Mol) Pyridin versetzt; die Mischung wird auf -78° unter Argon abgekühlt. Dann wird eine Lösung von 71,0 g (1 Mol) ß-Cyanethanol in 150 ml trockenem Ether tropfenweise über 1 bis 1,5 Stunden gegeben. Das Kältebad wird entfernt; man rührt weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur (unter Umständen werden erneut 300 ml Ether zugegeben, um eine bessere Rührfähigkeit zu gewährleisten). Rührer und Tropftrichter werden unter Argon entfernt; das Gemisch wird über Nacht bei 0° C aufbewahrt. Die festen Salze werden unter Argon entfernt; der Niederschlag wird zweimal mit je 75 ml Ether gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden im Vakuum konzentriert; der Rückstand wird schließlich im Vakuum destilliert: Siedepunkt 70 - 75° C/0,4 mm.
    [0037] Monochlor-ß-cyanethylphosphoramidite ( 3) :
    [0038] Zu einer Lösung des N-trimethylsilylierten sekundären Amins (0,1 Mol) oder sekundären Amin (0,2 Mol) in 30 ml Ether wird tropfenweise bei -20° C unter Argon eine Lösung von 17,2 g (0,1 Mol) ß-Cyanethylphosphordichloridit (1 ) in 60 ml Ether im Verlauf von 1 bis 1,5 Stunden zugetropft. Nach 20stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das Aminhydrochlorid entfernt; die verbleibende Lösung wird konzentriert. Der Rückstand wird schließlich im Vakuum in einer Kurzwegdestille destilliert.
    [0039] Die physikalischen Eigenschaften der so erhältlichen Verbindungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
    [0040] Die Figuren 1a, 1b und 1c zeigen 31P-NMR-Spektren von drei verschiedenen Monochlor-ß-cyanethylphosphoramiditen. Das N-MorpholInderivat ist thermisch zu instabil, um destilliert werden zu können. Die Präparation ist dennoch so rein, daß der Rückstand direkt für die Herstellung der aktivierten Nucleosid-Derivate verwendet werden kann. Die Reinheit ist gewöhnlich entsprechend den 31p-NMR-Spektren größer als 95%.
    [0041] Nucleosid-ß-cyanethylphosphoramidite:
    [0042] Die Darstellung der entsprechend geschützten Nucleosidß-cyanethylphosphoramidite ist aus Schema 3 ersichtlich.
    [0043] Die Synthese gelingt in Analogie zu Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981) mit einigen Verbesserungen in guten Ausbeuten.
    [0044] 3.0 m Mol des N-geschützten 5'-dimethoxytritylierten Desoxynucleos Ldswerden mit THF/Toluol azeotrop getrocknet, in 15 ml trocknen THF gelöst und mit 12,0 m Mol N, N, NDiisopropylethylamin zugegeben. Zu dieser Lösung werden unter kräftigem Rühren tropfenweise im Verlauf von 2 Minuten unter Argon 6,0 m Mol des Monochlor-ß-cyanethylphosphoramidits zugefügt. Nach kurzer Zeit (2 bis 5 Minuten) fällt Aminhydrochlorid aus. Die Suspension wird für weitere 30 bis 40 Minuten gerührt. Aminhydrochlorid wird unter Argon abfiltriert und gründlich mit trockenem THF (10bis 15 ml) nachgewaschen. Die gesamte organische Phase wird konzentriert und in Argon-gesättigtem Ethylacetat gelöst (100 ml). Die organische Phase wird zweimal mit je 50 ml Argon-gesättigter 10%-wässriger Natriumcarbonatlösung extrahiert. Die organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck zu einem Schaum eingedampft. Der Schaum wird mit wenig Ethylacetat oder Tduol aufgelöst und in n-Hexan bei -78° C gefällt. Die aktivierten Nucleoside sind stabil für mehrere Monate, wenn man sie unter Argon bei -20° C aufbewahrt. Figur 2 zeigt das 31P-NMR-Spektrum eines der aktivierten Desoxynucleoside.
    [0045] Synthese von d(CGGTACCG)
    [0046] 100 mg "controlled pore glass" (CPG), beladen mit insgesamt 8 μ Mol N-Isobutyryl-desoxyguanin (vgl. Tetrahedron Lett. 24, 747 (1983)) wird nacheinander mit den 5'-dimethoxytritylierten N-acylierten ß-Cyanethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen der Desoxynucleoside C, C, A, T, G, G und C kondensiert, wobei jeweils 20 bis 25 Äquivalente des Phosphoramidites in Acetonitril mit jeweils 75 - 80 Äquivalenten sublimiertem Tetrazol aktiviert werden. Die Kondensationen sind nach längstens 30 Minuten beendet; die Kopplungsausbeute beträgt mehr als 94%. Nach der Kondensation folgt jeweils eine Oxidation mit J2/H2O und Maskierung nicht umgesetzter 5'-OH-Gruppen mit Acetanhydrid. Anschließend erfolgt Abspaltung der Dimethoxytritylgruppe entweder mit. 3% Triσhloressigsäure in Nitromethan/1% Methanol oder ZnBr2/Nitromethan/1% H2O.
    [0047] Die Gesamtausbeute des geschützten Oktanucleotids am
    [0048] Ende aller Kondensationsschritte beträgt 55%, bezogen auf das trägergebundene Desoxyguanosin.
    [0049] Die vollständige Entschützung und Abspaltung vom Träger wird in einem Schritt durch Umsetzung der Glasperlen mit konzentriertem wässrigen Ammoniak (3 ml) bei 50° C in 16 Stunden erreicht. Anschließend werden die Glasperlen gründlich mit 50% wässrigem Methanol gewaschen (3 mal mit je 3 ml) Die flüssige Phase wird durch Einengen (Entfernung des Methanols) und Gefriertrocknung entfernt. Anschließend wird ein Aliquot nach Filtration durch Millipore-Filter durch HPLC an RP 18 gereinigt, wie aus Figur 3 ersichtlich ist. Die Fraktionen, die das 5'-dimethoxytritylierte Oligonucleotid enthalten, werden gesammelt; der flüchtige Puffer wird im Vakuum am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird mit 1 ml 80%-iger Essigsäure versetzt. Die Essigsäure wird nach 45 Minuten bei Raumtemperatur durch Gefriertrocknung entfernt.
    [0050] Das so erhaltene Material wird in üblicherweise (Liebigs Ann. Chem. 1978, 982) mit T4-Polynucleotidkinase und γ-32P-ATP phosphoryliert. Das erhaltene Produkt wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese im Vergleich zu einem Homo-oligodT-Wellenlängenstandard (Nucleic Acids Res. 6, 2096 (1979)
    [0051] (Figur 4) und gemäß Figur 5 durch Sequenzierung (Liebigs Ann.
    [0052] Chem. 1978, 982) charakterisiert.
    [0053] Die Figuren 6a bis 6c zeigen die Ergebnisse (HPLC, Gelelektrophorese, Sequenzierung) der Synthese von d (GGGATCCC) unter Verwendung der Nucleosid-ß-cyanethyl-N,N-dimethylphos- phoamidite. Die Figuren 7a bis 7c zeigen die Ergebnisse (HPLC, Gelelektrophorese, Sequenzierung der Synthese von d (GGGATATCCC) unter Verwendung der
    [0054] Nucleosid-ß-cyanethyl-N-morpholinophosphoamidite.
    [0055] Die in den Figuren 3, 6a und 7a wiedergegebenen Ergebnisse wurden durch Anwendung eines Gradienten von 10 -25 Vol.-% CH3CN, 5 min., und 25 - 29 Vol.-% CH3CN, 30 min. in 0,1 M Triethylammoniumacetat bei pH 7,0 erhalten.

    [0056]
    [0057]
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche
    1. Verfahren zur Herstellung von Oligonudeotiden der allgemeinen Formel I
    in der
    E eine Nucleobase,
    R1 Wasserstoff, Hydroxyl oder mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschütztes Hydroxyl und
    n eine ganze Zahl von 1 - 200 bedeuten,
    mit den folgenden Reaktionsschritten:
    a) Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel II
    (II)
    in der
    R1 wie oben definiert ist, sowie
    R2 eine in der Nucleotidchemie übliche Schutzgruppe und
    B' die gegebenenfalls mit in der Nucleotidchemie üblichen Schutzgruppen geschützte Nucleobase B bedeuten,
    mit einem Phosphinderivat der allgemeinen Formel III
    (III)
    in der R3 eine abspaltbare Schutzgruppe sowie X und L mit Hydroxylgruppen der Zuckerreste der Nucleotide bzw. Nucleoside reagierende Gruppen sind, in Gegenwart einer Base ,
    b) Umsetzung des in Schritt a) erhaltenen Nucleotidderivats der Formel IV
    (IV)
    in der B', R1 , R2 , R3 und L wie oben definiert sind, mit einem an einen polymeren Träger gebundenen Nucleosid der allgemeinen Formel V
    (V)
    in der B' und R1 wie oben definiert sind und T den polymeren Träger bedeutet, c) Oxidation des in Schritt b) erhaltenen trägergebundenen Nucleosidonucleotids der allgemeinen Formel VI
    (VI)
    in der B', R1, R2, R3 und T wie oben definiert sind, unter Ausbildung von Phosphotriestergruppen.
    d) Maskierung freier primärer 5'-OH-Gruppen, die bei der Reaktion gemäß Schritt b) nicht umgesetzt wurden, mit in der Nucleotidchemie üblichen, permanenten Schutzgruppen,
    e) Abspaltung der Schutzgruppe R2,
    f) gegebenenfalls ein- oder mehrfache Wiederholung der Schritte a) bis e) zur Einführung weiterer Nucleosidphosphat- oder Oligonucleosidphosphateinheiten, sowie
    g) Spaltung der Nucleosid-Trägerbindung und gegebenenfalls Abspaltung aller in den Oligonucleosidphosphaten vorhandenen Schutzgruppen,
    dadurch gekennzeichnet, daß
    man in Stufe a) als Phosphinderivat der allgemeinen Formel III eine Verbindung verwendet, in der R3 eine
    Gruppe der Formel VII
    (VII)
    in der
    die Gruppen Y, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, Methyl und/oder Ethyl und
    Z eine elektronenziehende Gruppe darstellen,
    wobei in dem Phosphinderivat der Formel III
    X Chlor, Brom, CN oder SCN, und
    L, CN oder SCN, einen sekundären Aminrest der Formel (VIII)
    (VIII)
    wobei die Gruppen R4 primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylreste mit 1 - 10 Kohlenstoffatomen sind, oder zusammen einen Cycloalkylrest mit 5 - 7 Kohlenstoff atomen, der ein oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- oder Sσhwefelatome als Heteroatome enthalten kann, bilden, oder Imidazol , Triazol , Tetrazol , 3-Nitro-1,2,4-Triazol , Thiazol, Pyrrol, Benztriazol, gegebenenfalls substituiert im Phenylrest, oder Benzhydroxytriazol, gegebenenfalls substituiert im Phenyrest, sind,
    bedeuten.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Phosphinderivat der Formel III einsetzt, in der X Chlor oder Brom und L einen sekundären Aminrest der Formel (VIII)
    (VIII)
    wobei die Gruppen R4 primäre, sekundäre oder tertiäre
    Alkylreste mit 1 - 10 Kohlenstoffatomen sind, oder zusammen einen Cycloalkylrest mit 5 - 7 Kohlenstoffatomen, der ein oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome als Heteroatome enthalten kann, bilden, oder Imidazol, Triazol, Tetrazol, 3-Nitro-1, 2,4-Triazol, Thiazol, Pyrrol, Benztriazol,gegebenen.falls substituiert im Phenylrest, oder Benzhydroxytriazol, gegebenenfalls substituiert im Phenylrest, sind.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Phosphinderivat der Formel (III) einsetzt, in der X Chlor, L eine N,N-Dimethyl-, -Diethyl- oder -DiLsopropylamingruppe oder N-Morpholinogruppe und R3 eine ßCyanethylgruppe ist.
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